流式数据结果分析门控的重要性

流式数据的分析往往需要进行一些列的门控（Gating）操作，我们俗称为圈门。而这个过程一般没有一个标准化的指南（除了一些临床简单的分析实现标准化），即使是领域内专家，在一些圈门问题上都存在个体之间的差异和分歧。很多圈门依据都来源于我们前期对细胞表型特点的认知和经验。但是有一些通用普遍的圈门手段如果应用得当，也能帮助我们有效排除杂信号，提高数据的可靠性。本文整理了一些常见的圈门方法及其作用意义。

流式数据圈门分析前我们需要先了解什么？

流式数据分析的工具：机载软件（eg.BDDIVA系统）、脱机软件（eg.Flowjo）。门的类型：线性门（在单参数峰图上应用），矩形门/十字门/椭圆门/不规则多边形门等（在双参数图上应用）。圈门思路：理清指标之间的层级关系，绘制所有检测指标树状关系草图(如下例图)。

影响结果分析的因素：

合理使用圈门手段，减少干扰因素的影响

一、阈值CD45泛白细胞标记物的作用

流式仪在采集样本时，会将悬液中的每一个颗粒或细胞记录为一个脉冲峰信号，所以我们看到的结果图上既包含目标细胞群的信号，也包含杂质噪音信号。上机时可以对包含在结果数据文件中的脉冲类型设置限制，这就是阈值或触发门。阈值是在记录样本之前设置的，作为一种排除不感兴趣的事件或噪音的手段。最常见的触发门设置是根据散射光测量的颗粒大小用来排除碎片。另一种常用的触发门是基于CD45的表达，在CD45+细胞上设门将基本上排除所有非白细胞事件。在有较多杂细胞干扰的样本分析中，我们建议都加上CD45分析。

案例1：如下图所示，该样本有红细胞污染，对CD45的阈值分别设置了高、中、低三个范围。左图A没有设置CD45+门，淋巴细胞的初始FSCvs.SSC门(第一列)没有受到高CD45阈值的影响(第一行)，但随着CD45阈值的降低，红细胞污染逐渐加重。淋巴细胞受红细胞污染，稀释了目标群体的占比，这导致了B细胞的百分比被人为地降低(第二列)。右图B:在淋巴细胞门控之前(第二列)，对CD45高表达的群体进行圈定(第一列)可以有效恢复目标群体比例。最终观察到的B细胞百分比相似(第三列)，只是是当CD45阈值较低时，细胞数量大大减少。

阈值设太低会有过量杂信号，信噪比低；阈值设太高，可能会排除掉部分甚至全部目标细胞群体信号，导致目标群体总体比例下降。恰当的设置阈值，能有效去除杂信号和不感兴趣的群体，提高信噪比。而为了确保排除的是噪音而非目标信号，设置一个合适的CD45等范表达的标志物的门辅助判断。

案例2：如下图所示，非免疫器官组织里免疫细胞总量占比非常少，所制备的组织单细胞悬液里多为实质/非实质细胞，会带来严重的抗体非特异性着色，染CD45有助于排出实验结果大量假阳性部分数据。

二、Time门的重要性

流式细胞术的原理是通过调节样品和鞘液之间的压差来建立液流层，使单个细胞在激光前通过从而进行检测。一般在样本刚开始采集的前几秒或者切换进样速度时，压力的爆发可能会导致高密度的细胞在激光面前通过，而后流速才会逐渐稳定；在接近采集结束时，样品体积大大减少，会再次影响流体动力学。期间观察到的events数增加或减少，多数是因为有小气泡或堵塞。这些问题，可以使用时间参数来排除，即Time门，手动分析排除。通过可视化时间与散射（或荧光）之间的关系来创建Time门。一些软件也有自动化插件来排除液流波动收集到的异常数据，如FlowAI、FlowClean。非层流对数据结果的影响可轻可重，这取决于流体不稳定性的程度和任何后续质量控制门的完整性。如果非层流情况出现在整个采样过程中，且情况很严重，可能会导致结果无法分析。因此，在采集样本中，时间参数是识别流体动力学中时间变化的有效QC工具。设置Time门，排除非层流信号，可以提高我们的数据质量。

三、Singlet门（去黏连）

在制备样本时，有时候会出现细胞聚团的情况，我们可以过细胞筛来减少这种情况，还有一些即使过筛也无法避免的粘连体细胞。细胞黏连除了会导致仪器堵机的不良危害外，其实粘连的细胞和单个细胞在通过激光照射形成的脉冲峰信号参数也是有差异的。细胞仪能收集脉冲峰的三种参数：Width（W）,Height（H），Area（A）。W代表了一个细胞经过激光照射的时间，与细胞或粒子的大小成正比，不受PMT电压设置的影响；H是对信号强度(最大荧光、大小或散点)的测量，受PMT电压的影响。A是利用宽度和高度测量，相对只是轻微的受PMT电压影响。当粘连细胞经过激光时，脉冲会因重合而变形。这种扭曲导致A和W的双重拉伸，而H保持不变。可以用Singlet门控来区分单个细胞和粘连细胞。常用的组合脉冲有两种：A和H（沿着对角线的细胞是单体的），H和W（H不变、W增大的是粘连体），A和W（A不变、W增大的是粘连体）。

去除粘连体的Singlet门控，可以减少一些假双阳性的情况（如CD3,CD19是非共表达而出现有双阳信号）。还有一些特殊的数据分析实验，如周期分析，去除粘连体的Singlet门控是必须的，可以减少双细胞的干扰；而另一些要分析聚合物的实验，就不太适合用Singlet门控了。

四、排除门(排除非目的细胞的门控)排除门选择的指标参数是目的细胞不会表达的，圈定的阴性群才包含目的细胞。这样可以有效排除非目的细胞对下游细胞群分析的干扰。常见的排除门，除了上述的Time门和Singlet门，还有死细胞排除和Lineage指标集合（多种非目的细胞指标抗体混合，用同一种荧光标记）。死细胞排除门：死细胞的存在，会有很强的自发荧光，造成本底信号增加，模糊阴阳分群边界甚至与阳性群交叠，同时还可能与抗体发生非特异性结合造成假阳性。因此可以利用一些染料对死细胞和活细胞进行区分，排除死细胞的干扰。仅做表染，不需要固定破膜的实验，可以使用膜不通透性的核酸染料进行染色，死细胞会被染成强阳性，活细胞为阴性（eg.PI、7-AAD、DAPI）；如需要固定破膜的实验则可以利用氨基性的死活染料染色加以区分（eg.BD-FVS系列染料）。Lineage排除门：Lineagecocktails是用来标记一种或多种下游分析不感兴趣的细胞群的多种指标集合，通常可以用同一种荧光标记。比如在分析人的DC细胞群时一般用Lin-,HLA-DR+确定，而其中的Lin就包含T、B、NK、单核的指标，排除了这些会表达HLA-DR的非DC细胞。死活区分的通道也可以和Lineage用同一个，干扰可以一起排除。

五、散射门散射门控（ScatterGates）涉及到的是流式仪激光照射细胞时收集到的前向散射光（FSC)和侧向散射光(SSC)，分别反应了细胞的大小和颗粒度。通常情况是作为分析的初始门，通过这两个参数能区分一些白细胞，如淋巴细胞、单核细胞、粒细胞，三者大小和颗粒度都有明显的区别，因此可以直接画门分析，尤其是在外周血裂红后的样本上尤其明显。六、特定亚群门控对于特定亚群的圈门比较依赖于有相关领域的经验，要清楚地知道特定细胞群体的大小、位置和指标分析顺序等相关表达属性。如CD4+T细胞、B细胞、单核细胞等。要如何精确地从混合样本中圈定出这些亚群，就需要有经验的人来指导或查阅相关资料。

案例1：CD3是分析T细胞的总指标，一般会作为总门先确定出来总T细胞群体，当我们去分析TCRγδ亚群时反圈门到CD3vs.SSC-A会发现它是一群CD3高表达的T细胞，所以在圈CD3的时候就要注意不要把这一部分高表达CD3的给排除掉了。

案例2：在分析T细胞的两个亚群（CD4+,CD8+）时候的圈门策略也要注意，是分别看CD3+CD4+和CD3+CD8+，还是先圈CD3再看CD4vs.CD8。当CD4和CD8不存在共表达的细胞的时候两种策略都可，不影响结果分析；但是如果存在少量的共表达或双阴性群体，如最近也比较火热的CD4-CD8-群体，那么我们就要采取后者，才能对这些群体真正的区分。综上，对于特定细胞群体的分析要了解清楚总群和亚群之间的表达特征，这对下游分析的准确性与可靠性都非常关键。反圈门的应用也是能有效帮助我们判断前面的总门是否圈取合适。同时对于一些稀有群体和若表达群体，设置门控对照也是很有参考价值的，下期我们详细介绍下各种对照的设置的意义和补偿准确调节的重要性。